عنوان :

تحقیق بررسی خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی جدایه های بزی

پاستورلا مولتوسیدا

تعداد صفحات : ۸۰

نوع فایل : ورد و قابل ویرایش

چکیده:

پاستورلا مولتوسیدا یک باکتری میله ائی و کوکوباسیل گرم منفی که در ناحیه نازوفارنکس و دستگاه گوارش خیلی از حیوانات وحشی و اهلی یافت میشود . در انسان اغلب عامل سلولیتها و آبسه های موضعی متعاقب گزش و گازگرفتگی و خراشیدگی ها توسط حیوانات است  دستگاه گوارش دومین سایت عفونت برای پاستورلاهاست که تاکنون شناخته شده است. پاستورلاهای جدا شده از  عفونتهای انسانی را بیشتر پاستورلا مولتوسیدای تحت تیپهای مولتوسیدا و سپتیکا تشکیل می دهد . امروزه با استفاده از روشهای مولکولی ازجمله REA typing , REP-PCR Typing و کپسولار تایپینگ،تفریق و تعیین تحت گونه ها بسیار دقیق و آسان گردیده است .

بیماریهایی که توسط پاستورلا مولتوسیدا ایجاد می‌شوند دامنه میزبانی وسیعی دارند. گاو، گوسفند، بز، خوک، سگ و گربه، خرگوش، شتر و طیور و میزبانهای دیگر هر کدام به نوعی تحت آسیب پاستورلاها بویژه پاستورلا مولتوسیدا قرار دارند.

در این مطالعه خصوصیات فنوتیپی و ژنوتیپی ۱۰ جدایه بزی پاستورلا مولتوسیدا مورد ارزیابی قرار گرفت..بر اساس نتایج فنوتیپی حاصل از این گزارش اکثر جدایه ها متعلق به پاستورلا مولتوسیدا تحت گونه سپتیکا میباشدو  زیر گونه سپتیکا از فراوانی بالائی بر خوردارند.این امر می تواند اهمیت این تحت تیپ را در مطالعات اپیدمیولوژیک در بز های ایران متذکر گردد.. اگر چه در این مطالعه پاستورلا مولتوسیدا تحت گونه سپتیکا فراوانی بالائی را نشان می دهد (۸۰ در صد) اما مطالعات اخیر نشان داده اند که الگوی تخمیر دلسیتول و سوربیتول هماهنگی کافی با روشهای ژنتیکی تعیین تحت تیپ ندارندو تایید نهائی جداسازی این عامل در ایران نیاز به بررسی ژنتیکی بر اساس توالی یابی ۱۶S rRNA  و دو رگه سازی DNA-DNA  دارد.

در این مطالعه از ۱۰ نمونه مطالعه ۹ نمونه متعلق به پاستورلا مولتوسیدا تیپ A و یک نمونه متعلق به تیپ D بودند.

مقایسه نتایج حاصل از این مطالعه با مطالعات جدایه های گوسفندی به تشابه این یافته ها اشاره دارد و به نظر می رسد که بر خلاف نتایج فنوتیپی در مطالعه ژنوتیپی اختلافی چندان بین بز و گوسفند وجود نداشته باشد.

همچنین مطالعه عوامل سه ژن دخیل در حدت یعنی tox A,tbp A وPfha 1  به تشابه فراوانی این عوامل به آنچه در گوسفند یافت شده است تاکید می کند.در نتیجه می توان نتیجه گرفت اگر چه این عوامل از حیوانات سالم جدا شده اند ولی متعاقب استرس می توانند ظرفیت بالائی را برای ایجاد بیماری در بز داشته باشند.از سوی دیگر اگر چه مخزن بودن بز برای انتقال سویه های پاستورلا مولتوسیدا به گوسفند نیازمند مطالعات بیشتر است اما به نظر می رسد در صورت وجود چنین ارتباطی احتمال انتقال سویه های بزی برای ایجاد بیماری در گوسفند متعاقب استرس به ویژه در گله های مختلط گوسفند و بزی به عنوان یک فاکتور خطر می بایستی در نظر گرفته شود.

 واژه های کلیدی: خصوصیات فنوتیپی ، خصوصیات ژنوتیپی، کشت ،جداسازی ، جدایه ، پاستورلا مولتوسیدا

فهرست مطالب

چکیده    ۱
مقدمه    ۲
فصل اول: کلیات    ۴
بخش اول- کلیات    ۵
طبقه بندی    ۵
۱-۱-خانواده پاستورلا سه(Pasteurellace )     ۵
۲ -۱-۱- جنس پاستورلا(Pasteurella  )    ۶
۲-۱- پاستورلا مولتوسیدا    ۱۰
۱-۲-۱- تاریخچه    ۱۰
بخش دوم: ۲-۲-۱- جداسازی و خصوصیات بیوشیمیایی و کشت    ۱۵
۳-۲-۱واکنش های بیوشیمیایی    ۱۷
۴-۲-۱- روشهای تعیین تیپ    ۱۷
۱-۴-۲-۱- روشهای تعیین فنوتیپ    ۱۷
الف- تقسیم بندی بر اساس شکل کلنی    ۱۷
ب- روشهای سرمی    ۱۸
روش روبرت    ۱۸
روش کارتر    ۱۸
روش نامیوکا و موراتا    ۱۹
روش هدلستون    ۲۰
ج- روشهای بیوشیمیایی    ۲۰
روش تعیین تحت تیپ     ۲۰
بخش سوم:۳-۱- بیماریزایی    ۲۲
۱-۵-۲-۱-سپتی سمیک هموراژیک     ۲۳
۲-۵-۲-۱-پنومونی در گاو ،گوسفند،خوک    ۲۴
پنومونی در گوسفند    ۲۴
پنومونی گاوی    ۲۶
۳-۵-۲-۱-رینیت آتروفیک در خوک     ۲۷
۴-۵-۲-۱- وبای مرغان    ۲۸
بخش چهارم: ۵-۱- عوامل حدّت در پاستورلا مولتوسیدا     ۳۰
۱-۵-۱- کپسول ( CAPSUL )    ۳۰
نقش کپسول در بیماریزائی    ۳۱
الف:  نقش ضد فاگوسیتوز    ۳۱
ب:  مقاومت در برابر خشکی    ۳۱
ج:  قدرت تداخل با دستگاه کمپلمان    ۳۲
د:  قدرت چسبیدن به سلولهای میزبانی    ۳۲
۲-۵-۱- لیپوپلی ساکارید ( Lipopolysaccharid )    ۳۲
۳-۵-۱- فیمبریه و پروتئین های چسباننده(Adhesine)    ۳۴
۴-۵-۱-توکسینها    ۳۵
۵-۵-۱-پروتئینهای تنظیم کننده و اکتساب کننده آهن    ۳۶
بخش پنجم: مروری بر مطالعات گذشته    ۳۹
فصل د وّم :مواد و روشها   ( Material & Methodes )    ۴۳
۱-۲- وسایل    ۴۴
۱-۲-۲- دستگاهها     ۴۴
۲-۲-۲- مواد      ۴۵
-الیگونوکلئوتیدهای مورد استفاده برای انجام PCR    ۴۶
– آنزیم ها    ۴۷
– نشانگرهای وزن مولکولی DNA     ۴۷
– محلولها و بافرهای مورد نیاز برای الکتروفورز ژل آگارز    ۴۷
۲-۱-۹-۴- محلولها و بافرهای مورد نیاز جهت انجام PCR    ۴۸
۱-۲-  مرحله نمونه برداری    ۴۸
۲-۲- مرحله کشت ،جداسازی وتعیین هویت جدایه ها    ۴۹
الف-۲-۲- روش کار    ۴۹
ب – مرحله تعیین هویت    ۴۹
۳-۲- روش تعیین بیوتیپ جدایه های پاستورلا مولتوسیدا     ۵۱
۴-۲-تعیین تیپ کپسولی  جدایه ها با استفاده از روش  Multiplex-PCR    ۵۲
– الکتروفورز DNA با ژل آگارز     ۵۳
تعیین حضور  ژنهای دخیل در ویرولانس با استفاده از روش Multiplex-PCR
( toxA  )- ( tbpA ) – (pfha1 )     ۵۴
فصل ســــوّم : نـتـایـج    ۵۶
نتایج نمونه برداری    ۵۷
نتایج  کشت و جداسازی     ۵۷
نتایج فنوتایپینگ  جدایه ها     ۵۷
نتایج کپسولار تایپینگ در جدایه ها     ۵۸
نتایج ویرولانس تایپینگ در جدایه ها     ۶۰
فصل چهارم : بحث    ۶۱
منابع    ۶۳

فهرست منابع

۱- زهرائی صالحی،ت،  شایق، ج ،١٣٨۶، میکروب شناسی دامپزشکی وبیماریهای میکروبی (بخش بیماریهای باکتریائی)، انتشارات دانشگاه تهران.

۲-Angen, O., Mutters, R., et al.1999.Taxonomic relationships of the (Pasteurella ) haemolytica complex as evaluated by DNA–DNA hybridizations and 16S rRNA sequencing with proposal of Mannheimia haemolytica gen.nov., comb.nov., Mannheimia glucosida sp.nov.,

۳- Angen O, Christensen H, Bisgaard M, Frederiksen W, Olsen JE (2005) Characterization of sucrose-negative Pasteurella multocida variants, including isolates from large-cat bite wounds. J Clin Microbiol 43(1):259-70.

۴-Benkirane A., De Alwis M.C.L.(2002) Hemorrhagic septicaemia, its significance, prevention, and control in Asia.Vet Med Czech, 47, 234-240.

۵- Blackall PJ, Christensen H, Beckenham T, Blackall LL, Bisgaard M (2005) Reclassification of Pasteurella gallinarum, [Haemophilus] paragallinarum, Pasteurella avium and Pasteurella volantium as Avibacterium gallinarum gen. nov., comb. nov., Avibacterium paragallinarum comb. nov., Avibacterium avium comb. nov. and Avibacterium volantium comb. nov Int J Syst Evol Microbiol 55(Pt 1):353-62.

۶- Blackall PJ. Fernández RP, Colíndres HL, Velásquez QE, Soriano VE (2005) Protection conferred by bivalent and trivalent infectious coryza bacterins against prevalent serovars of Avibacterium (Haemophilus) paragallinarum in Mexico. Avian Dis 49(4):585-7.

۷- Blackall PJ, Bojesen AM, Christensen H, Bisgaard M (2007) Reclassification of [Pasteurella] trehalosi as Bibersteinia trehalosi gen. nov., comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol 57(Pt 4):666-74.

۸-Blackall, P.J., Pahoff, J.L., Marks, D., Fegan, N.and Morrow, C.J., 1995.Characterization of Pasteurella multocida isolates from fowl cholera outbreaks on seven turkey farms.Aust.Vet.J.

۹-Boerlin, P., Siegist, H.H., Burnens, A.P., Kuhnert, P., Mendez, P., Pretat, G.,13 Lienhard, R., Nicolet, J., 2000.Molecular identification and epidemiological tracing 14 of Pasteurella multocida meningitis in a baby.J.Clin.Microbiol.38, 1235-1237.

۱۰-Bosch M, Garrido E, Llagostera M, de Rozas AMP, Badiola I &Barbe J (2002a) Pasteurella multocida exbB, exbD and tonB genes are physically linked but independently transcribed.FEMS Microbiol Lett 210: 201–۲۰۸٫

مقدمه:

پاستورلامولتوسیدا یکی ازعوامل باکتریائی بسیار مهم در بیماریهای گاو ، گوسفندو بز بوده و علاوه بر آن در خوک و طیور نیز ایجاد بیماری می‌کند.این باکتری در گاو عامل سپتی سمی هموراژیک (Hemorrhagic septicemia)  و یکی از عوامل دخیل  در تب حمل و نقل و پاستورلوز ریوی گاوی  (Bovine pneumonic pasteurellosis) می‌باشد.در گوسفند نیز پاستورلامولتوسیدااز عوامل دخیل در پاستورلوز ریوی محسوب می‌شود. این بیماری یکی از مشکلات جدی در طب گاو ، گوسفند و بز بوده و امروزه تلاشهای بسیاری در جهت مبارزه و پیشگیری از این بیماری در حال انجام می‌باشد.

از خانواده پاستورلاسه باکتریهایی همچون پاستورلا مولتوسیدا ,منهمیا همولایتیکا وبی بیرشتاین تره هالوزی اغلب جدایه های حاصل از پنومونی در گوسفند و بز را بخود اختصاص می دهند و دارای درصد واگیری و مرگ و میر بالائی درگله های گوسفند و بزی هستند .

پاستورلا مولتوسیدا از مجاری فوقانی تنفسی اغلب حیوانات  نشخوارکننده سالم و وحشی  جدا گردیده است هرچند که حضور این باکتری در ریه باعث ایجاد پنومونی مزمن  میگردد .این باکتری را در کشتهای ریوی گرفته شده از گوسفندان و  بزهای کوههای  مکنزی تلف شده   جدا نموده اند  و آنرا علت مرگ و میر در بره ها و بزغاله ها میدانند.  این باکتری ندرتا” با ایجاد پلوروپنومونی فیبرینوزی و مرگ و میرزیاد بروز مینماید ولی معمولابصورت  تحت حاد یا مزمن با ایجاد آپسه و چسبندگی پرده جنب  مشخص میگردد .

پاستورلا مولتوسیدا با طیف وسیع میزبانی و عامل بسیاری از بیماریهای مهم در حیوانات اهلی و وحشی است که بصورت اولیه و ثانویه عامل پنومونی در گاو و گوسفند و بز و عامل سپتی سمی هموراژیک در گاو و گاومیش است از لحاظ آنتی ژن کپسولی این باکتری به ۵ گروه کپسولی A,B,D,E,F  تقسیم بندی  شده است.

پاستورلا مولتوسیدا دارای کلنی های کم پشت و مدور , خاکستری رنگ , غیر همولایتیک , موکوئید یا غیر موکوئید  ,تولید ایندول فراوان , در رنگ آمیزی جدایه های تازه بصورت بییپولار دیده میشوند , جدایه های موکوئید و کپسولدار ارتباط نزدیکی با بیماریزائی دارند .

تقسیم‌بندی پاستورلا مولتوسیدا  به هر دو روش سروتیپی و ژنوتیپی مورد ارزیابی قرار گرفته و سیستم‌های متعددی برای آن مطرح شده است.از معروفترین روشهای تقسیم‌بندی سروتیپی این باکتری روش Carter (1994) می‌باشد.این روش یکی از اساسی‌ترین روشهای شناسائی باکتری پاستورلامولتوسیدا برای مطالعات اپیدمیولوژیک  است. از روشهای دیگر روش   نامیوکا – موراتا و هد لستون است که روش دومی بویژه حائز اهمیت است. اما این روشهای تعیین سروتیپی برای پاستورلامولتوسیدا با ایراداتی روبرو می‌باشند که عبارتند از:

 ۱- تولید آنتی بادی اختصاصی و استاندارد عملاً با مشکلاتی رو به رو است و آزمایشگاه های خاص این آنتی‌بادیها را در حجم محدود تولید می‌کنند.

۲- انجام چنین فرایندی زمان بر بوده و این روشها قادر به تعیین تیپ همه سویه‌های جدا شده نمی باشند.

اخیراً با ابداع روش جدیدی برپایه Multiplex PCR بجای روش Carter در تیپ‌بندی پاستورلا مولتوسیدا برای تعیین تیپ‌های کپسول قدم مهمی در این راه برداشته شده است. این روش تکرار ﭘذیر، سریع و مطمئن بوده و به جای serotyping به کار می‌رود.

از آن جایی که هیچ گونه اطلاعاتی در خصوص جدایه های بزی در ایران وجود ندارد مطالعه حاضر اولین مطالعه در خصوص این جدایه ها در ایران است که به بررسی فنوتیپی,ژنوتیپی و نیز ظرفیت بیماری زایی در ایران می پردازد.

بخش اول- کلیات

طبقه بندی:

۱-۱-خانواده پاستورلا سه(Pasteurellace )

خانواده پاستورلاسه (Pasteurellacea ) یک خانواده وسیع و متنوع ازپروتئوباکتریهای گرم منفی بنام گاما پروتئوباکتر که دسته ای ازارگانیزمهای گرم منفی میله ای اند که در انسان و حیوانات ایجاد بیماری می کنند.علاوه بر جنس پاستورلا(Pasteurella)، منهمیا (Mahemia)و اکتینو باسیلوس ها(Actionobacillus ) و هموفیلوسها از سایر باکتریهای مهمی هستند که در این دسته حضور دارند.بجز بیماری حاصل از اکتینو باسیلوس، اکتینومیستوکومیتانس(A.actinomycetemcomitans) و چند گونه دیگر اعضای این گروه عمدتا موجب عفونتهایی در انسان می‌گردند که بواسطه گاز گرفتگی یا خراش بواسطه حیوانات حاصل می آیند.

۲ -۱-۱- جنس پاستورلا(Pasteurella  )

در حال حاضر طبقه بندی مناسبی برای جنسهای این خانواده مفروض نیست و دانشمندان در تلاشند جنسها و گونه‌های مختلف متعلق به این خانواده را به نحو شایسته ای طبقه بندی نمایند. تا سال ۲۰۰۸ تعداد  جنســهای این گونه تا ۱۴ جنس رسیده است.  مطالــعــات دورگــه ســازی DNA           (DNA hybrizdation) ما بین اعضای این خانواده بیش از ۵۰ درصد همولوگی را نشان داده است . از سال ۱۹۸۵ گونه‌های جدیدی به جنس پاستورلا یا اکتینوباسیلوس اضافه گردیده است . مطالعات بر روی rRNA S 16 نشان داد که گونه‌هایی که سابقا” پاستورلا خوانده می‌شدند همانند پاستورلا پنوموتروپیکا (P.penomotropica)، پاستورلا اوره آ(P.ureae)، پاستورلا آئروژن(P.aerogen)  و پاستورلا همولایتیکا (P.heamolytica) اصولا پاستورلای واقعی(Pasturella senus stricto) نبوده و احتمالا می‌بایستی  در جنس اکتینو باسیلوس و یا در جنس جدیدی قرار گیرند( Janda, 2006).

در قدم اول برای حل چنین مشکلی  ۱- پاستورلا اوره آ به جنس اکتینو باسیلوس انتقال داده شده و اکتینو باسیلوس اوره آ خوانده شدMutters et al. 1986 )  (  ۲- پاستورلا آناتیس به گالی باکتریوم انتقال داده شده و گالی باکتریوم آناتیس خوانده شد( Mutters et al. 1985)  ۳-  پاستورلا  اویوم به هموفیلوس انتقال و هموفیلوس اویوم خوانده شد( Mutters et al. 1986)   ۴ – پاستورلا گالیناروم  به اوی باکتریوم انتقال و اوی باکتریوم گالیناروم خوانده شد ( Blackall et al 2005)   ۵- پاستورلا گرانولو ماتیس به منهمیا  منتقل و منهمیا گرانولوماتیس خوانده شد (  Angen et al 1999)  ۶- پاستورلا همولایتیکا به منهمیا منتقل و منهمیاهمولایتیکا خوانده شد ۷- پاستورلا لیمفانژیتیس نیز از  انتروباکتریاسه به پاستورلا  منتقل شد ۸- پاستورلا تره هالوزی تیپ T ابتدا به پاستورلا همولایتیکا و سپس به بی برشتاین منتقل و بی برشتاین تره هالوزی   خوانده شد (Blackall et al 2007).

 در حال حاضر درجنس پاستورلا  گونه های ذیل شناسائی شده اند :

۱)      مولتوسیداو تحت گونه های ( مولتوسیدا ، گالیسیدا ،سپتیکا )

۲)      پاستورلا پنوموتروپیکا

۳)      پاستورلا تستودینیز

۴)      پاستورلا  آئروژنز

۵)      پاستورلا کنیس

۶)      پاستورلا  داگماتیس

۷)      پاستورلا لانگه آتیس

۸)      پاستورلا استوماتیس

۹)      پاستورلا   بتییه ئی

۱۰) پاستورلا کابالی

۱۱) پاستورلامیرئی

۱۲) پاستورلا اسکینزی

این باکتری از نقطه نظر رده بندی در سلسله باکتریها ،شاخه پروتئوباکتریا ، کلاس گاما پروتئوباکتریا، خانواده پاستورلاسه،جنس پاستورلا و گونه مولتوسیدا قرار گرفته است .

 در حال حاضر در این جنس گونه های مختلفی به شرح ذیل وجود دارند :

در سال ۱۹۸۵، چندین گونه جدید پاستورلائی بر پایه دورگه سازی DNA توصیف گردید.این گونه‌ها شامل پاستورلا داگماتیس(P.dagmatis)، پاستورلا کانیس (P.canis)، پاستورلا استوماتیس(P.stomatis)، پاستورلا آناتیس(P.anatis)، پاستورلا لانگاآ (P.langaa) بودند. این گونه‌ها سابق بر این   بیوتیپ های هنریکسن(Henriksen)  پاستورلا پنوموتروپیکا خوانده می‌شدند،  در این میان  پاستورلا داگماتیس و پاستورلا کانیس بیوتیپ ۶ پاستورلا مولتوسیدا را تشکیل می‌دادند.

علی رغم تلاشهای فراوان برای تعریف اعضای واقعی جنس پاستورلا هنوز برخی از جنسها وجود دارند که احتمالا به دیگر جنسها انتقال یابند.از جمله این پاستورلاها می‌توان به پاستورلا بته ای (P.betteie )، پاستورلا کابالی (P.caballi)، پاستورلا تستودینیز ( P.testudiniz )، پاستورلا لنفانژیتیس، پاستورلا گرانول ماتیس ( P.ganulmatis ) می‌باشند.اکنون پاستورلا گرانولوماتیس به همراه برخی از بیوتیت های پاستورلا همولایتیکا به جنس جدید منهمیا انتقال یافته اند.

جهت دریافت و خرید متن کامل مقاله و تحقیق و پایان نامه مربوطه بر روی گزینه خرید انتهای هر تحقیق و پروژه کلیک نمائید و پس از وارد نمودن مشخصات خود به درگاه بانک متصل شده که از طریق کلیه کارت های عضو شتاب قادر به پرداخت می باشید و بلافاصله بعد از پرداخت آنلاین به صورت خودکار  لینک دنلود مقاله و پایان نامه مربوطه فعال گردیده که قادر به دنلود فایل کامل آن می باشد .