عنوان :

تحقیق تولید اسید سیتریک از کاه گندم به روش تخمیر حالت جامد

تعداد صفحات :۹۰

نوع فایل : ورد و قابل ویرایش

چکیده

مقاله حاضر به نولید اسید سیتریک از کاه گندم به روش تخمیر حالت جامد  در قالب ۷ فصل می پردازد. که عبارتنداز ک شناخت کلی اسید سیتریک، بیوشیمی تخمیر و متابولیسم تولید اسید سیتریک، روشهای تولید اسید سیتریک، تخمیر در بستر جامد (SSF)، کاه گندم، جداسازی و خالص‌سازی اسید سیتریک، بررسی جنبه اقتصادی

تعریف کشت حالت جامد

ارائه تعریف واحد و دقیقی از کشت حالت جام مشکل است. مویانگ و همکاران در سال ۱۹۸۳ این واژه را چنین توصیف کردند: به تمامی فرآیندهایی که در آنها M.oها از مواد نامحلول در آب، در شرایط بدون حضور آب آزاد استفاده می‌کنند، کشت حالت جامد گفته میشود. با افزایش میزان مولکولهای آزاد آب، کشت از حالت جامد به حالت دوغابی و سپس به حالت سوسپانسیونی از ذرات جامد تبدیل می‌شود. در کشت حالت جامد، رطوبت به طور جذب شده، کمپلکس در شبکه جامد یا در حالت پیوند با مواد جامد است. در این نوع کشت نمی‌توان مرز مشخصی برای میزان آب آزاد موجود. معین کرد. حد نهایی مقدار رطوبت، تابعی از قدرت جذب سوبسترا است.

مراحل اصلی فرآیند کشت حالت جامد

معمولاً تمامی فرآیندهای کشت حالت جامد مراحل یکسانی دارند که آنها را به ترتیب زیر بیان می‌کنیم:

۱- مرحله آماده‌سازی مواد خام جامد

۲- مرحله پخت (که سوبسترا را  سترون یا حداقل پاستوریره کند)

۳- تهیه مایه تلقیح مناسب با روشهای سنتی یا روشهای کشت خالص

۴- انجام تلقیح روی جامد مرطوب (سوبسترا)

۵- گرماگذاری در شرایط کشت مناسب

۶- برقراری شرایط بهینه و نگهداری آن در حد ممکن

۷- برداشت محصول به صورت ماده جامد مرطوب

۸- خشک کردن ماده جامد مرطوب یا استخراج محصول از مواد جامد

واژه های کلیدی: اسید سیتریک، کاه گندم، کشت حالت جامد، بیوشیمی تخمیر

فهرست مطالب

دیباچه   ۱
فصل اول: شناخت کلی اسید سیتریک    ۲
مقدمه   ۳
۱-۱) پیشینه   ۴
۱-۲) سوبستراهای استفاده شده بای تولید اسید سیتریک   ۶
۱-۳)  خواص فیزیکی اسید سیتریک    ۷
۱-۴) خواص شیمیایی اسید سیتریک    ۱۱
۱-۵) منابع طبیعی اسید سیتریک    ۱۳
۱-۶) کاربرد اسید سیتریک    ۱۵
۱-۷) مشتقات اسید سیتریک    ۲۰
۱-۷-۱) نمکها   ۲۰
۱-۷-۲) استرها   ۲۱
فصل دوم: بیوشیمی تخمیر و متابولیسم تولید اسید سیتریک    ۲۳
۲-۱) بیوشیمی تخمیر   ۲۴
۲-۲) بیو شیمی تخمیر   ۲۴
۲-۲-۱) تشکیل اسید سیتریک از پیرووات   ۲۷
فصل سوم: روشهای تولید اسید سیتریک    ۳۱
۳-۱) M.O های مولد اسید سیتریک   ۳۲
۳-۱-۱) مخمرها   ۳۳
۳-۱-۲) آسپرژیلوس نایجر   ۳۳
۳-۱-۲-۱) روش جداسازی سویه A.niger مولد اسید سیتریک    ۳۴
۳-۱-۲-۲) شناسایی اختصاصی A.niger   ۳۵
۳-۲) روش کشت سطحی    ۳۷
۳-۳) روش کشت غوطه‌ور    ۳۷
۳-۴) تخمیر در بستر جامد   ۳۸
۳-۴-۱) روش تخمیر کوجی   ۳۸
۳-۵) تأثیر شرایط محیطی بر تولید اسید سیتریک    ۳۹
۳-۵-۱) شرایط تغذیه‌ای A.niger    ۳۹
۳-۵-۲) تأثیر فلزات trace در تولید اسید سیتریک    ۴۰
۳-۵-۳) تأثیر نیتروژن و فسفر در تولید اسید سیتریک    ۴۰
۳-۵-۴) تأثیر متانول در تولید اسید سیتریک    ۴۱
فصل چهارم: تخمیر در بستر جامد (SSF)    ۴۲
۴-۱) تعریف کشت حالت جامد   ۴۳
۴-۲) تفاوتهای اساسی بین کشت حالت جامد و کشت غوطه ور   ۴۴
۴-۳) مقایسه کشت حالت جامد با سایر فرآیندهای تخمیری    ۴۶
۴-۴) مزایایی سیستم کشت حالت جامد    ۴۸
۴-۵) معایب سیستم کشت حالت جامد   ۴۸
۴-۶) مراحل اصلی فرآیند کشت حالت جامد    ۴۹
۴-۷) پارامترهای مؤثر بر فرایند SSF در تولید اسید سیتریک    ۵۰
فصل پنجم: کاه گندم    ۵۲
۵-۱) تعریف کاه و ویژگیهای ساختاری    ۵۳
۵-۱-۱) کربوهیدراتهای ساختمانی    ۵۴
۵-۱-۱-۱) سلولز    ۵۴
۵-۱-۱-۲) همی سلولز   ۵۵
۵-۱-۱-۲) لیگنین    ۵۵
۵-۲) ترکیب شیمیایی کاه گندم    ۵۹
۵-۳) پیش تیمار (Pretreatment) کاه گندم    ۵۹
۵-۳-۱) روشهای فیزیکی پیش تیمار کاه گندم    ۶۰
۵-۳-۱-۱) پیش تیمار کاه گندم با بخار    ۶۰
۵-۳-۲) روشهای شیمیایی پیش تیمار کاه گندم    ۶۱
۵-۳-۲-۱) پیش تیمار کاه با اوره    ۶۳
۵-۳-۳) پیش تیمار بیولوژیکی کاه گندم    ۶۳
فصل ششم: جداسازی و خالص‌سازی اسید سیتریک    ۶۴
۶-۱) استخراج اسید سیتریک    ۶۵
۶-۱-۱) فروشویی (Leaching)   ۶۵
۶-۱-۲) روش رسوبگیری    ۶۶
۶-۱-۳) روش استفاده از استخراج با حلال    ۶۸
۶-۱-۴) روش استفاده از غشاء    ۶۹
۶-۱-۵) مقایسه بین روشهای مختلف جداسازی اسید   ۷۰
۶-۲) خالص سازی اسید سیتریک    ۷۱
فصل هفتم: بررسی جنبه اقتصادی    ۷۳
۷-۱) کشورهای عمده‌ تولید کننده و مصرف کننده محصول    ۷۴
۷-۲) اهمیت اقتصادی طرح    ۷۴
۷-۳) میزان واردات اسید سیتریک    ۷۵
۷-۴) واحدهای تولیدی و واحدهای در دست اجرای اسید سیتریک    ۷۸
منابع مورد استفاده    ۸۱

منابع مورد استفاده:

۱- بیوتکنولوژی- میکروبیولوژی صنعتی، تألیف:‌ ولف کروگر- آنالیز کروگر، مترجمان: دکترسید علی مرتضوی- مهندس مهدی کریمی- مهندس رسول کدخدایی- مهندس سعید رحیمی یزدی، انتشارات دانشگاه فردوسی مشهد.

۲- میکروبیولوژی صنعتی، تألیف: اختر الملوک کاظمی و سیری (۱۳۷۲) دانشگاه صنعتی شریف.

۳- بیوتکنولوژی صنعتی، تألیف: دکتر سید عباس شجاع الساداتی، دانشگاه تربیت مدرس

۴- مبانی بیوتکنولوژی و میکروب‌شناسی صنعتی، تألیف:‌ دکتر حسن لامع و دکتر محمد رضا احسانی، دانشگاه آزاد اسلامی (۱۳۷۵)

۵- بیوتکنولوژی میکروبی، تألیف: محمد رضا صعودی، دکتر فریدون ملک زاده، دکتر شیرین ملک زاده، دانشگاه تهران (۱۳۸۰)

۶- تکنولوژی آماده‌سازی و نگهداری غلات، تألف:‌ دکتر ناصر رجب زاده (۱۳۷۵)

۷- مبانی فناوری غلات، تألیف دکتر ناصر رجب زاده، دانشگاه تهران (۱۳۸۰)

۸- غلات       تألیف: ناصر خدا بنده           دانشگاه تهران

۹- گندم        تألیف:‌ هادی کریمی

۱۰- سالنامه آمار بازرگانی خارجی جمهوری اسلامی ایران سالهای ۸۲-۱۳۷۷

۱۱- آمار وزارت صنایع (۱۳۸۳)، وزارت صنایع تهران

۱۲- سید صفاعلی فاطمی، سید عباس شجاع الساداتی، «بهینه‌سازی تولید اسید سیتریک با استفاده از طراحی آزمایشها در روش تخمیر حالت جامد با بکارگیری A.niger،‌ دانشگاه تربیت مدرس، امیر کبیر، سال یازدهم، شماره ۴۳٫

۱۳- سید صفا علی فاطمی، سید عباس شجاع الساداتی،‌ «تولید اسید سیتریک از تفاله سیب با استفاده از تخمیر حالت جامد، مقالات علمی پژوهشی،‌ سال هجدهم ، شماره یک و دو (۱۳۷۸)

۱۴- Y.D. Hang, E. E. Woodams, “A process for leaching citric acid from apple pomace fermented with A.nigr in SSF”, MIRCEN jornal, (1989), 5, 379-382.

۱۵- Y.D. Hang, E. E. Woodams, “Solid state fermentation of apple pomace for citric acid production.” MIRCEN jornal, (1986), 2, 283-287

۱۶- S.A. shojaosadati, V. Babaeipour. “Citric acid production from apple pomace in multi- layer Packed bed solid- state bioreactor.”, process Biochemistry 37. (2002), 909-914.

۱۷- W.Q.XU, Y.D. Hang, “Roller culture techni que for citric acid production by A.niger”, process Biochemistry, (1988)

۱۸- Y.D. Hang. “Microbial production of citric acid in fixed- bed column. Bioreactors”, Biotechnology letters, Vol 10, No.6 421-426 (1988)

۱۹- Y. D/ Hang, E.E. woodams, “utilization of grape pomace for citric acid production by SSF.” , Am.j Enol.vitic, vol/.37 , No.2, (1986)

۲۰- Y.D. Hang, E.E. woodams, ‘production of cirtic acid from corncobs. By A.niger”. , Bioresource technology 65 (1998) 251-253.

۲۱- T. Roukas, P. Kotze kidou, ‘Pretreat ment of date syrup to increase citric acid production”. Enzyme and Microbial technology 21, 273-276 (1997) .

۲۲- Al- obaidi, “The use of deionised date syrup as a substrate for citric acid production.”, Biote chnology letters, (1979), 1, 153-158.

۲۳- V.S. shankaranad, B. K. Lonsane, “coffee- husk; an inexpen sive subtrate for production of citric acid by A.niger in SSF.”, Jornal of microbiology & Biotechnology 10, 165-168, (1994)

۲۴- P.S. randenberghe, C. R. soccol, A. pandey, J. M. Lebeault, “SSF for the synthesis of citric acid by A.niger.”,  Bioresource Technology 74, (2000), 175-178

۲۵- S.K. Khare, Krishna Jha, A.P. Gandhi, ‘citric acid production from okaraybg SSF.”, Biore source Teehnology 54 (1995), 323-325.

۲۶- M. Y. Lu, I. S. Maddox, J. D. Brooks, “Application of a multi- Layer Packed- bed reactor to citric acid production in SSF using A. niger.”, process Biochemistry, vol. 33, No.2 PP.117-123, (1998)

۲۷- M.Y. Lu, j.P. Brooks, I. S. Maddox, ‘citric acid production by SSF in a packed – bed reactor using A.niger.”, Enzyme and Microbial Technology 21, 392-397, (1997)

۲۸- T. Roukas, P. Kotzekidou, “production of citric acid from Brewery wastes by surface fenmentation using A.niger.”, journal of food science- 225, vol. 51 No. 1, (1986)

۲۹- T. Roukas, E. Alichanidis, “citric acid production from beet molasses by cell recycle of A.niger,”, Indus trial Micobiology, 7 (1991), 71-74.

۳۰- G.N. Q azi, C. N. Gaind, S.K. chaturred, “pilot – scale citric acid production with A.niger under several conditions.”, jornal of fermentation and bioengineering, vel. 69, No. 1,72 – ۷۴, (۱۹۹۰)

۳۱- اطلاعات اولیه مورد نیاز طرح تولید اسید سیتریک،‌ وزارت صنایع،‌ معاونت توسعه صنعتی ، میترا رزمجو (۱۳۷۷)

۳۲- قارچ شناسی پزشکی، تألیف: دکتر مسعود امامی، دکتر پریوش کردبچه،‌ دکتر مهین مقدمی،‌ دکتر فریده زینی، انتشارات دانشگاه تهران،‌ (۱۳۷۳).

۲-۱) نقش فیزیولوژیکی اسید سیتریک

اسید سیتریک متابولیت چرخه کربس است. در طی این چرخه کربوهیدراتها، چربیها، پروتئین‌ها به دی اکسید کربن و آب تبدیل می‌شوند. ضمناً این چرخه انرژی لازم برای رشد، تولید مثل، حرکت، تولید شیمیایی مواد و . . . . میکروارگانیسمها را فراهم می‌کند. چرخه کربس را می توان طوری هدایت کرد که در آن تولید اسید سیتریک به بیشترین مقدار خودش برسد. این موضوع اساس فرآیندهای تخمیری تولید اسید سیتریک را تشکیل می دهد.

۲-۲) بیوشیمی تخمیر

شکل (۲-۱) یک روند ساده شده از انواع واکنشهای آنزیمی متناسب با سنتز و شکستن اسید سیتریک را نشان می‌دهد. اسید سیتریک در محیطهای کشت با PH=1.8-2  دفع و تولید می شود. یعنی در شرایط اسیدی که اکثر موجودات زنده قادر به تحمل آن نیستند. در مورد PH درون میتوکندری یا حتی سلول میکروارگانیسمهایی که در این محیط زندگی می کنند، اطلاع زیادی در دست نیست ولی برای رفع این تناقض تفاسیری وجود دارد. Blumenthal در سال ۱۹۶۵ مسیرهای متابولیک مختلف قارچها را توضیح داده است. در آسپرژیلوس نایجر %۷۸ از قند مصرفی در مسیر (EMP) Embden- Meyerhof- Parans مصرف می‌شود. در محیط تخمیر اسید ستیریک ، این درصد تغییر می نماید. تحت این شرایط گلیکولیزهم از مسیر EMP و هم از مسیر هگز و منوفسفات (HMP) به طور مداوم فعال است. بطوریکه حداکثر فعالیت مسیر EMP در مرحله رویشی و حداکثر فعالیت HMP در مرحله تولید کونیدی رخ می دهد. در خلال رشد مقدار اسید سیتریک در محیط کشت کم است، در حالیکه بیشترین مقدار اسید سیتریک توسط سلولهایی تولید می شود که در فاز تکثیر نیستند. بنابراین کشتهایی که در آنها اسپورگذاری رخ می‌دهد، تقریباً فاقد اسید سیتریک هستند.

بنابراین تصور می‌شود که مسیر  EMP نقش اصلی را در گلیکولیز تخمیر اسید سیتریک دارد. Verhoff و Spradin در ۱۹۷۶ موازنه جرمی برای سیستمی که ورودی آن پیرووات و محصولاتش اسید سیتریک، اسید اگزالیک و دی اکسید کربن می باشند، برقرار نمود.

تجزیه نتایج به ارائه دو شماتیک متابولیک منجر گردید. یکی از این شماتیکها با کار cleland   و johnson در ۱۹۵۴ یکی  بود و دیگری شامل کربوکسیلاسیون دو ملکول پیروات و تولید دو ملکول از اگزالواستات بود. یکی از اینها  توسط اگزالواستیک هیدرولاز به اسید اگزالیک و استات هیدرولیز می شد. بخش استات در تراکم با مولکول دیگر اگزالواستات، اسید سیتریک تولید می کند. مطابق با این طرح،اگزالات به گلایوکسیلاتی که با سوکسینات، توسط عمل ایزوسیترات لیاز در جهت مخالف ایزوسیترات متراکم شده، احیاء می گردد. دو مولکول دی اکسید کربن روی مسیری که برای کربوکسیلات دو ملکول پیروات در شروع شماتیک استفاده شده، کم می‌شود.

مسیر EMP:

وجود آنزیمهای این مسیر در آسپرژیلوس نایجر محرز است. آلدولاز آسپرژیلوس – نایجر برای فعالیت به روی نیاز دارد. سیترات یک باز دارنده بازخور شناخته شده فسفو فروکتو کیناز (PEK) است و آشکارا تعدیل این بازداری برای تجمع خوب اسید سیتریک نیاز دارد. چند تن از محققین نشان دادند که در اثر کمبود منگنز، تجمع یونهای  در سلول (طی تولید اسیدیته) رخ می دهد که این شرایط، روی حذف بازداری PEK توسط سیترات مؤثر است.

۲-۲-۱) تشکیل اسید سیتریک از پیروات

ابتدا اگزالواستات به واحد بزرگتر متصل شده و در نتیجه باعث چرخش این واحد به مقدار ۱۵ درجه آنگستروم نسبت به واحد با جرم بزرگتر چرخش پیدا کرده و برای اتصال با استیل کوآنزیم A آماده می‌شود. این چرخش باعث پلاریزه کردن بعضی پیوندهای مشخص شده و نیز گروه هیستیدین آنزیم با اکسیژن گروه کربونیل اگزالواستات واکنش داده و کربن اگزالواستات را برای اتصال به استیل کوانزیم A آماده و مهیا می کند. از طرفی یک هیستیدین دیگر با گرفتن پروتون از گروه متیل، استیل کوآنزیم را به فرم انولات تبدیل نموده، بنابراین استیل کوآنزیم A را به اگزالواستات نزدیک می نماید و به این ترتیب پیوند کربن – کربن ایجاد شده و ساخت سیتریل کوانزیم A را باعث می شود. تا این زمان جایگاه فعال آنزیم که تا بحال کاملاً پوشیده بود با یک چرخش ایجاد مکانی را می کند که دارای آسپارتات می باشد. آسپارتات با گرفتن یک مولکول آب باعث هیدرولیز تیواستری و در نهایت، آزاد شدن کوانزیم A می شود. پس از این حالت آنزیم به حالت اولیه خود برگشته و سیترات را آزاد می‌کند. از نکات مورد توجه در چرخه کربن سرعت تولید سیترات است که کاملاً به ATP وابسته است. گزارشات حاکی از آن است که ATP یک مهار کننده آلوستریکی برای سیترات سنتتاز است و با کاهش درجه اشباعیت آنزیم در نهایت باعث کاهش تولید سیترات می شود. میکروارگانیسمها  در مراحل اولیه تولید اسید و در هنگام ساخت کونیدی از مسیر هگزوز مونوفسفات استفاده می‌کنند و چنانچه پیشتر ذکرشد، در اکثر مواقع از طریق مسیر EMP عمل می‌کنند که در واقع ۸۰% کل متابولیسم نیز از این طریق صورت می‌گیرد.

با کاربرد کربن رادیواکتیو، دانشمندان ثابت کردند که در تولید اسید سیتریک، ۴۰% توسط استیل کوآنزیم A و ۶۰% توسط ترکیب اگزالواستات به اشتراک گذاشته می‌شود.

 این فرآیند هنگامی که تولید اسید صورت نمی‌گیرد، با استفاده از آنزیم گلی اگزالواستات هیدرولاز بدست آمده از آسپرژیلوس نایجر مورد تأیید قرار گرفت. اسید سیتریک در چرخه کربس توسط آنزیم اکونیتاز به ایزوسیترات مبدل می‌شود. (این آنزیم یک کاتابولیزکننده در چرخه کربس است). در طی تولید و تجمع اسید سیتریک، اکونیتاز هیچگونه فعالیتی را نشان نمی‌دهد. همچنین با اندازه‌گیری اکونیتاز در میتوکندری به تعادل بین سیترات و ایزوسیترات پی می‌بریم و به این نتیجه می رسیم که مهار آنزیم اکونیتاز، تولید اسید را تا ۹۵% افزایش می دهد. اکونیتاز دارای یک اتم آهنی است که به چهار گوگرد در سیتئین پیوند برقرار نموده است. به این ساختار کمپکس گروههای پروتئینی آهن- گوگرد نیز می گویند. اکونیتاز ابتدا با هیدراته و سپس دهیدراته کردن سیترات باعث تعویض H و OH بین کربن‌های ۲ و ۳ شده و سیترات را نهایتاً به ایزوسیترات تبدیل می کند و در نتیجه باعث کاهش سیترات کل می شود. مقادیر بسیار کم پراکسید هیدروژن، آهن و مس، آنزیم اکونیتاز را مهار و باعث افزایش تولید  می‌شوند. از اثرات مستقیم بر روی تولید اسید ستیریک، عمل آنزیمهای ایزوسیترات دهیدروژ ناز و ایزوسیترات لیاز است که باعث شکسته شدن ایزوسیرات شده و تعادل آنرا از سمت سیترات به ایزوسیترات پیش می برند و در واقع اکونیتاز را تقویت و فعالت می کنند. مطالعات نشان می دهند که فروسیانید، اسید ستیریک، ATP و NADH باعث مهار آنزیمهای فوق شده و در نهایت باعث افزایش تولید اسید می‌شوند ولی NADP و NAD و ADP باعث تحریک این آنزیمها شده و باعث کاهش تولید می شوند. از اثرات غیر مستقیم  آنزیمهای دیگر فعالیت پیرووات کربوکسیلاز است که پیروات را به اگزالواستات، یعنی ترکیب اصلی در تولید اسید تبدیل می‌کند. این آنزیم بسیار مهم بوده و معلوم شده است که آسپارتات باعث مهار این آنزیم و در نهایت باعث کاهش تولید اسید می ‌شود. دی اکسید کربن آزاد شده، توسط پیروات کربوکسیلاز گرفته شده و پیروات را به اگزالواستات مبدل می‌کند. بنابراین دی اکسید کربن آزاد نمی‌شود. گلوکز می تواند از طریق چرخه پنتوزفسفات نیز کاتابولیزه و تجزیه شود. آنزیمهای این سیکل در A.niger مشخص شده‌اند. از آنجایی که اسید سیتریک از طریق ترکیب استیل کوانزیم A و اگزالواستیک اسید تحت تأثیر سیترات سنتتاز ساخته می‌شود و اگزالواستات در چرخه اسید سیتریک (کربس) ساخته می‌شود، هنگامی که اسید سیتریک تجمع یافته و غلظتش زیاد می شود، این چرخه با شدتهای متفاوتی محدود یا بسته می‌شود. بنابراین برای فراهم کردن اگزالواستات به یک سری واکنش نیازمندیم که به نام واکنشهای آناپلروتیک معروفند. اولین و کلیدی‌ترین آنزیم در این چرخه، آنزیم پیروات کربوکسیلاز است و همانگونه که قبلاً ذکر شد، پیروات و  را به اگزالواستات ، فسفات معدنی و ADP تبدیل می کند. این واکنش بستگی به یونهای Mg و k داشته و استیل کوآنزیم A برای واکنش مورد نیاز است. آسپارتات از فعالیت پیروات کربوکسیلاز جلوگیری می کند، اما از آنجایی که  کتوگلوتارات دهیدروژناز در مدت تجمع اسید سیتریک حضور نداشته، لذا غلظت آسپارتات باید کم بوده و بازدارند  گیش حداقل باشد. دومین قسمت واکنش آناپلروتیک، تبدیل فسفوانل پیرووات و  به اگزالواستات و ATP در حضور ADP توسط آنزیم فسفوانول پیروات کربوکسی کیناز است که سیستم به Mg و Mn یا k و آمونیوم محتاج است.

البته اگر استات و یا ترکیبات آلیفاتیکی نظیر آلکانهای خطی به عنوان منبع کربن بکار روند، سومین مرحله واکنش آناپلروتیک رخ می دهد. در غیاب گلوکز چرخه گلی اگزالات رخ می دهد که ایزوسیترات لیاز و مالات سنتتاز حضور دارند. در حضور گلوکز چرخه گلی اگزالات انجام نمی گیرد، اگر چه ایزوسیترات لیاز هنوز به طور جزئی فعال است.

۳-۱) M.O های مولد اسید سیتریک

اسید سیتریک به میزان فراوانی توسط A.niger،  برخی از مخمرها و باکتریها تولید می‌شود. این یک پدیده طبیعی در این موجودات نیست، بلکه تحت برخی از فشارهای متابولیکی در طی رشد میکروب، این اسید بدست می‌آید و البته انتخاب سویه‌های مناسب و بدست آوردن موتانهایی که متابولیسم آنها مستعد برای تولید اسید سیتریک می باشد، به این مسأله کمک می‌کند. بیشتر آزمایشات و تحقیقات انجام شده در تولید اسید بر روی محیطهای مناسب رشد و نمو A.niger انجام شده است. این آزمایشات با استفاده از بررسی نیازهای غذایی M.O و روشهای مؤثر در بهبود فعالیتهای آنزیمهای حیاتی آن در مراحل متعدد تخمیر انجام گرفته است.

برای تولید صنعتی از موتانهای A.niger و سویه‌های نزدیک به آن مثل A.vantali استفاده می‌کنند. آسپرژیلوس‌ها در مقایسه با سویه‌های پنی سیلیوم در زمان یکسان مقادیر بیشتری اسید تولید می کند. در ضمن محصولات نامطلوب فرعی مثل اسید اگزالیک، ایزوسیتریک و گلوکونیک در این موتانها کمتر تولید می شوند. تریکودرماها از نقطه نظر کاربردی و به دلیل تجزیه مطلوب سلولزی پس از آسپرژیلوس‌ها و مخمرها قرار دارند. تولید اسید سیتریک با مخمرها نسبت به A.niger دارای تفاوتهای ذیل می باشد:

۱- مخمرها به مقادیر Mn حساس نیستند. (برخلاف A.niger)

۲- مخمرها به جای تولید اسید در PH پایین در PH=5 تولید اسید می کنند.

۳- برای شروع کار، آنزیم سیترات سنتتاز مخمرها برخلاف A.niger به محدودیت نیتروژن نیاز ندارد.

۴- مخمرها به فاکتورهای رشد مثل تیامین، بیوتین، اینوزیتول و . . . . احتیاج دارند.

۳-۱-۱) مخمرها

این M.O ها قادرند از منابع قندی و آلکانی استفاده کرده و اسید سیتریک تولید نمایند. مخمرها علاوه بر تولید اسید سیتریک در PH=5 قادرند اسید ایزوسیتریک نیز تولید کنند که در PH=7-9.5 قادر به تبدیل آن به اسید ایزوسیتریک می‌باشند. همچنین افزودن موادی مثل فلوئوراستات، فلوئورو استامید و استات سرب به محیط کشت، تولید اسید سیتریک را زیاد می‌کند.

۳-۱-۲) آسپرژیلوس نایجر:

این M.o از رده آسکومیستها بوده، تولید مثل معمولاً غیرجنسی است و میسلیوم آن به مقدار زیادی منشعب شده و دیواره عرضی بیرنگی را ایجاد می کند. سلولهای این M.o چند هسته‌ای می باشند. میسلیوم هوایی آن در انتهای خود برجسته بوده و منتهی به وزیکول با استریگماهای متعدد می شود و از انتهای این استریگماها، کنیدیها به صورت دانه‌های تسبیح به دنبال هم قرار گرفته‌اند. به این M.o کپک سیاه هم می گویند که به دلیل منظره سیاه‌رنگی است که در محیط کشت مناسب بعد از اسپورزایی پدید می ‌آورد. اصولاً رنگ کلونیهای این کپک ارتباط مستقیم با عناصر کمیاب محیط کشت دارد. حتی در بسیاری از موارد که به طریق شیمیایی یا فیزیکی نمی‌توانند وجود یا عدم بعضی از عناصر کمیاب را مشخص کنند، با کاربرد A.niger کمیت و کیفیت آنرا تعیین و اندازه‌گیری می کنند. در سال ۱۹۵۲ دو دانشمند به نامهای مارتین و واترز تأثیر مورفولوژیکی A.niger را در تولید اسید سیتریک از ملاس قند بررسی کردند. در سال ۱۹۸۲ B revic و Cimerman تجمع میسلیوم به شکل کروی پایدار منشعب و در هم پیچیدگی جزئی شبکه هیف را به نام Pellete مطرح  کردند. سپس در سال ۱۹۸۶ Brevic ، پلت‌ها را با چند mlit  قطر تعریف نمود و نشان داد  که سوسپانسیون پلت‌ها نسبت به حالت شاخه دار و منشعب دارای ویسکوزیته کمتری می باشد. این کپک را به صورت طبیعی می‌توان از خاک آبمیوه‌های کپک زده و . . .  و با کمک محیطهای اختصاصی رشد کپک نظیر PDA و SAD جدا نمود.

۳-۱-۲-۱) روش جداسازی سویه آسپرژیلوس نایجر مولد اسید سیتریک

سویه‌ای که قادر به تولید اسید سیتریک باشد از محیط‌هایی که خود به طور طبیعی در این جهت غنی‌سازی شده‌اند، آزمایش و استفاده می‌شود. بدین منظور از خاک اطراف درختان مرکبات و  . . .  نمونه‌برداری انجام می‌شود. روش جداسازی عمومی A.niger از نمونه خاک بدین ترتیب است که ابتدا از خاک توسط آب مقطر سوسپانسیونی تهیه می‌شود که پس از رسوب ذرات خاک و مواد معلق آن از مایع رویی شفاف برای ادامه کشت استفاده می شود. سپس توسط پی پت ، ۰٫۱ میلی لیتر  از مایع رویی برداشته و به تدریج حدود ۷ تا ۸ قطره روی محیطهای انتخابی (MEA, PDA, SDA) کشت داده می‌شود. این سه محیط به دلیل دارا بودن PH اسیدی به عنوان محیط انتخابی برای رشد کپکها بکار می‌روند. پس از ریختن این محیطها در پلیت با کشت قطره‌ای یا زیگزاک M.oها را در سطح محیطها پخش می کنند و در دمای ۳۰ ، به مدت ۴ تا ۶ روز گرمخانه گذاری می‌نمایند. در این شرایط M.o  شروع به تولید اسپور می‌کند. نخست جداسازی A.niger به روش شناسایی مورفولوژیکی و تشخیص کنیدیهای قهوه‌ای یا سیاهرنگ انجام می‌شود. از این کنیدیها در شرایط استریل برداشته و برای کشت اختصاصی روی محیطهای کشت مذکور، کشت داده می‌شوند.

پس از سه بار تجدید کشت می‌توان اطمینان حاصل نمود که نمونه جدا شده A.niger است. این M.o را روی محیط شیبدار در دمای  ۴ نگهداری نموده و به ترتیب مورد آزمایش قرار می‌دهند.

۳-۱-۲-۲) شناسایی اختصاصی آسپرژیلوسی نایجر

برای تعیین اختصاصی گونه‌های آسپرژیلوس، کلونیهای آنرا روی محیط کشت Czapeck Agar بررسی می کنند. این محیط شامل: ساکارز، نیترات سدیم، فسفات دی پتاسیم، سولفات منیزیم با هفت مولکول آب، سولفات آهن با هفت مولکول آب، آگارو آب مقطر می‌باشد. چهار نکته اصلی در تشخیص سویه A.niger به ترتیب عبارتند از:

۱- رنگ کلونی                                      ۲- شکل کلونی

۳- نوع ستونک (کروی و صاف)                 ۴- نوع استریگما

۳-۲) روش کشت سطحی

جهت دریافت و خرید متن کامل مقاله و تحقیق و پایان نامه مربوطه بر روی گزینه خرید انتهای هر تحقیق و پروژه کلیک نمائید و پس از وارد نمودن مشخصات خود به درگاه بانک متصل شده که از طریق کلیه کارت های عضو شتاب قادر به پرداخت می باشید و بلافاصله بعد از پرداخت آنلاین به صورت خودکار  لینک دنلود مقاله و پایان نامه مربوطه فعال گردیده که قادر به دنلود فایل کامل آن می باشد .